Standardowe przygotowanie:
Przygotuj mieszany wzorzec podstawowy, dokładnie ważąc (± 0,01 mg) około 10 mg każdego wzorca odniesienia kavalactone w 10 ml kolbie miarowej. Dodaj 7,0 ml metanolu i sonikuj aż do rozpuszczenia. Rozcieńczyć do objętości metanolem i wymieszać.
Uwaga: Alternatywnie, przygotuj standard podstawowy kavain w podobny sposób i wykorzystaj współczynniki odpowiedzi kavalactone do oceny ilościowej.
Rozcieńczyć standard giełdowy, aby utworzyć co najmniej czteropunktową krzywą standardową. Sugerowane standardowe rozcieńczenia masy wyjściowej wynoszą 1:10, 1:25 i 1: 100 przy użyciu metanolu.
Uwaga: Standardy należy przechowywać w temperaturach chłodniczych (0–5 ° C). Kawalaktony ulegają szybkiemu rozkładowi po 48 godzinach. Zalecane jest przygotowanie nowych wzorców odniesienia przed każdą analizą.
Aparat
· Skalibrowana waga analityczna z dokładnością do ± 0,01 mg
· Kolba miarowa, klasa A, różne rozmiary
· Fiolki, chromatografia z nakrętką
· Wysokowydajny system chromatografii cieczowej zgodnie z opisem w rozdziale USP. Sprawdź i udokumentuj, że aparatura, oprogramowanie i podsystemy spełniają wymagania wydajnościowe dotyczące Kwalifikacji Instalacyjnej / Kwalifikacji Operacyjnej (IQ / OQ).
· Filtr 0,45 µm, nylon Gelman Acrodisc (P / N 4426), polipropylen Whatman Puradisc ™ ( nr kat. 6788-2504), szkło Whatman GD / X ( nr kat. 6894-2504) lub równoważny Sonicator
· Kolumna, YMCbasic, 5 µm, 4,6 x 250 mm ( nr kat. BA99S05-2546WT). Równoważna kolumna, YMC J'Sphere H80, 4µ, 4,6 x 250 ( nr kat. JH08S04-2546WT).
Odczynniki
· Woda, gatunek HPLC lub Nanopure
· Metanol, klasa HPLC
· Acetonitryl, gatunek HPLC
· Kwas fosforowy, gatunek odczynnika ACS
Przygotowanie próbki:
Materiał roślinny
Dokładnie zważyć (± 0,1 mg) około 750 mg drobno zmielonej łodygi, obierania lub materiału korzeniowego.
Umieścić materiał w 50 ml kolbie miarowej wraz z 40 ml metanolu / wody (70/30). Sonikuj przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
Pozostaw kolbę do ostygnięcia do temperatury pokojowej i rozcieńcz do objętości metanolem / wodą (70/30) i wymieszaj.
Przefiltruj i umieść próbkę w fiolce i nakrętce HPLC.
Proszek i miękki ekstrakt (pasta)
Dokładnie zważyć (± 0,1 mg) około 100 mg ekstraktu w 50-ml kolbie miarowej. (Masa 100 mg opiera się na 50-60% zawartości kavalactonu w ekstrakcie.) Uwaga: Ostrożnie ujednorodnij ekstrakt przed pobraniem próbki. Dokonuje się tego poprzez umieszczenie ekstraktu w pojemniku zanurzonym w łaźni z gorącą wodą o temperaturze 60–80 ° C, aż do swobodnego przepływu.
Dodaj 40 ml metanolu i sonikuj przez 10 minut lub do momentu rozpuszczenia się wszystkich substancji stałych.
Pozostaw kolbę do ostygnięcia do temperatury pokojowej i rozcieńcz do objętości metanolem i wymieszaj.
Przefiltruj i umieść próbkę w fiolce i nakrętce HPLC.
Próbki proszku
Ekstrakt z Kava jest często mieszany lub suszony rozpyłowo na różnych nośnikach. Aby z powodzeniem przetestować próbki proszku, konieczne jest opracowanie etapu przygotowania próbki, który odzyska kavalaktony z nośnika. Można to osiągnąć najpierw ekstrahując czystym metanolem lub wodą.
Warunki chromatograficzne:
Kolumna: YMCbasic, 5 µm, 4,6 x 250 mm
Temperatura kolumny: 40 ° C
Szybkość przepływu: 0,6 ml / min dla YMCbasic; 1,0 ml / min dla J'Sphere
Faza ruchoma: izokratyczny 0,1% kwas fosforowy: alkohol izopropylowy: acetonitryl (64:16:20 v / v)
Detekcja: 220 nm (246 nm alternatywnie w celu poprawy selektywności)
Objętość wtrysku: 5 µl
Czas pracy: 30 minut
Procedura:
Przygotuj wzorcowe roztwory wzorcowe i przygotuj próbki zgodnie z zaleceniami.
Wykonaj pojedyncze wstrzyknięcie ślepej próby rozpuszczalnika ekstrakcyjnego.
Wykonaj pojedynczy zastrzyk standardowych preparatów.
Utwórz wykres liniowości standardowych powierzchni pików w porównaniu ze standardowymi stężeniami.
Wykonaj pojedyncze wstrzyknięcia preparatów próbek.
Obliczyć stężenie kavalactone w próbce.
Dopasowanie systemu:
Współczynnik korelacji regresji liniowej musi wynosić ≥ 0,999. Rozdzielczość między pikami demetoksyoksyangoniny i yangoniny musi wynosić ≥1,8.
Shaanxi Y-Herb Biotechnology Co., Ltd.